Pyroséquençage et PCR

[Reysford]

Bonjour!

J'espère que quelqu'un pourra m'éclairer sur la méthode de pyroséquençage car malgré mes efforts et recherches, je ne comprends toujours pas la méthode. Je commence à désespérer Je vais donc réécrire la "marche à suivre" donnée au cours.

1. On fragmente l'ADN, on le dénature et on ajoute l'amorce. --> OK

2. Amplification par PCR et liaison à des billes de 28 micromètres. --> Là, je comprends plus.. La PCR est la réaction de polymérase en chaîne qui sert à amplifier le DNA. C'est-à-dire qu'après cette étape, comme au début on a de l'ADN dénaturé, on aura plusieurs copies simple brin? Quelle en est l'utilité?

3. Une bille par puits. Cette bille est couverte de copies d'un fragment d'ADN. --> OK, mais pourquoi plusieurs copies? Et dans chaque puits une séquence différente, c'est juste?

4. Le signal est lu pour chacun de puits. --> Je sais que lorsque la polymérase intègre un nucléotide, il y a formation de pyrophosphate qui est converti en ATP qui à son tour active la luciférine. Celle-ci génère de la lumière, donc le signe qui est mesuré. Je comprends que lorsqu'il y a un grand pic, plusieurs nucléotides ont été incorporés etc. Mais je ne comprends pas comment il est possible de savoir auquel de nucléotides correspond le signal-lumière...
De plus, comme il y a plusieurs copies de la séquence dans un puits, il y aura plusieurs signaux-lumières simultanés, non? Ou bien il y a seulement une seule polymérase?

Si quelqu'un pouvait m'aider, même pour une même question, j'en serai grandement reconnaissant

[darrigan]

Bonsoir,
En attendant qu'un aimable biologiste passe te répondre il a un autre sujet qui parlait du pyroséquençage, as-tu vu ?
Ici : http://forum.scienceamusante.net/viewto ... f=8&t=1974

[Reysford]

Ah, merci pour le lien, mais ça m'aide pas beaucoup..

[colin]

Je ne suis pas spécialiste et la technique est récente... enfin elle n'existait pas quand j'ai fait mes études !

Effectivement il y a plusieurs copies identiques de fragments d'ADN pour chaque bille. L'objectif est à mon avis de maximiser le signal lumineux en fixant d'un seul coup autant de nucléotide que de copies d'ADN. On libère plus de pyrophosphate et donc plus de lumière.

L'autre point qu'il faut bien comprendre, c'est que chaque type de nucléotide est ajouté un par un de façon séquentielle (différence importante par rapport à la méthode de Sanger). Par exemple si on ajoute A et que rien ne se passe alors on tente un autre nucléotide jusqu'à obtenir un signal lumineux. Si deux nucléotides identiques se suivent le signal lumineux sera double.

[neoange]

Bonjour,

c'est la première fois que je répond sur ce forum, donc j'espère que je pourrais t'aider avec mes explications.

Je comprend un peu ton mal de compréhension sans avoir fait la technique et d'avoir vu une machine en action.

Je vais essayer de reprendre dans l'ordre, il faut que tu sache tout d'abord que le pyroséquençage est utilisé pour le séquençage de petite région (20-30 nucléotides) connu, il faut absolument savoir ce que tu chercher réellement pour faire une séquence de référence type de ta mutation. Cette technique est parfaite donc pour la routine hospitalière avec la recherche de mutation précise connu ou pour la méthylation ADN avec les îlot CpG par exemple.

L'amplification de l'ADN par PCR sert bien comme tu l'as compris à augmenter le nombre de copies de ta zone d'ADN à séquencer. Sauf que l'ADN est double brin et non simple brin. Pour que tu comprennes le principe, je t'invite à aller sur youtube pour trouver de nombreuses vidéo expliquant le procédé. Les billes servent ensuite à capturer ton ADN, nous utilisons ceci en pyroséquençage pour deux raisons:
-La première est pour purifier ton produit, l'ADN double brin va se fixer laissant à ce moment l'ADN monobrin (tes amorces) et le reste des dNTPs dans ton puits de PCR
- la deuxième raison est aussi pour normaliser tes produits, tu as le même nombre de billes pour chacun de tes patients, qui fixeront le même nombre de ton fragment d'ADN amplifié. Ceci te permettra alors d'avoir la même quantité dans chaque puits, permettant une quatification exacte par rapport à l'intensité.

Pour la dernière partie, tu as bien compris la réaction. Cependant il te manque une donnée, le pyroséquenceur contient 4 réservoir avec dans chaque réservoir soit que des dATP, dGTP, dCTP et enfin des dTTP. Le pyroséquenceur va ensuite pour chaque cycle envoyé l'un après l'autre dans chaque puits les dNTPs et mesure le signal lumineux à chaque fois. Le même principe est utilisé dans le séquençage haut-débit ion torrent de thermofischer, mais là c'est un autre sujet.

Voilà si tu as d'autres questions n'hésite pas, j'espère avoir pu répondre à tes questions

Neoange